JC-1法检测线粒体膜电位，以及检测线粒体膜电位的操作步骤！

线粒体膜电极电势差查重化学生化制剂盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一个种以 JC-1 为荧光探头，高效灵活地查重肿瘤细胞膜、公司或纯化的线粒体膜电极电势差变换的化学生化制剂盒，行使适应用在旱期的肿瘤细胞膜凋亡查重，CCCP 作为一个诱导型线粒体膜电极电势差骤降的抗体阳性参考。该化学生化制剂盒仅使适应用在科学研究邻域，不容易使适应用在科学研究判断或另一个不同的用途。

产品组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、配好的凉茶 JC-1 染色法工作的液：

取适量 JC-1 Stain (200×)，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH₂O 的比例稀释 JC-1，剧烈 Vortex 充分溶解并混匀 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×)，

混匀后即为 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为 1ml，其它培养器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每 0.5～1.0×10⁶ 细胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

2、布置阳型比较：

推存 CCCP(10mM)都依据 1:1000 的比例怎么算融入到生殖上皮癌细胞膜核锻炼液中，就稀释至 10μM，加工生殖上皮癌细胞膜核20min。之后都依据下述形式装入 JC-1，对其进行线粒体膜电势的测试。相对多半数生殖上皮癌细胞膜核，常常 10μM CCCP 加工 20min 后线粒体的膜电势会*减退，JC-1 印染后探究应呈精彩纷呈荧光；而正常人的生殖上皮癌细胞膜核经 JC-1 印染后应显视网红荧光。相对独特的生殖上皮癌细胞膜核，CCCP 的影响浓硫酸浓度和影响时间间隔或者有着各个，需立刻参考使用有关的医学文献材料确认。

3、这对于悬浮物神经元：

• 取 1～6×10⁵ 细胞，重悬于 0.5ml 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

• 注入 0.5ml JC-1 复染本职工作液，弄反多次混匀。細胞致力于箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育时间，以每 1ml JC-1 Buffer(5×)申请加入 4ml 蒸溜水的比例怎么算，配好的凉茶有益健康的 JC-1 Buffer(1×)，并平放于冰浴。

• 37℃孵育完后， 4℃ 600g 离心力 3～4min，奠定神经元核。弃上清，注意力一定要不想吸除神经元核。

• 用 JC-1 Buffer(1×)洗洁 2 次：添加 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬组织，4℃ 600g 离心力法3～4min，滤渣组织，弃上清。再添加 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬组织，4℃ 600g 离心力法

3～4min，凝固細胞，弃上清。

• 就用一些 JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光高倍显微镜或激光行业共集焦高倍显微镜观查，也能否用荧光分光光度计监测或普鲁士蓝染色上皮细胞仪分折。

JC-1法检测线粒体膜电位，以及检测线粒体膜电位的操作步骤！

4、面对贴壁血细胞：

重视：在贴壁神经元，如果你祝愿进行荧光分光光度计或流式的神经元仪论文检查，前先搜集神经元，重悬后参阅透明桌面神经元的论文检查的办法。

• 吸除 6 孔板训练液，会根据明确实验英文以免必不可少可不可以用 PBS 或以外的别的有效悬浊液洗衣机清洗肿瘤细胞核系第一次，放入 1ml 肿瘤细胞核系训练液。肿瘤细胞核系训练液中可不可以含出血清和酚红。

• 加进 1ml JC-1 印染做工作液，宽裕混匀。神经元致力于箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育哺乳期间，决定每 1ml JC-1 Buffer(5×)入驻 4ml 减压纯净水的百分比，调制不过要适的 JC-1 Buffer(1×)，并储放于冰浴。

• 37℃孵育结尾后，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1×)洗衣 2 次。

• 融入 2ml 生殖细胞养育液，养育液中还可以含带血清和酚红。

• 荧光电子显微镜或离子束共精准定位电子显微镜下观查。

5、我们对纯化的线粒体：

• 把制备好的 JC-1 刺绣岗位液如何再用 JC-1 Buffer(1×)做好稀释工作 5 倍。

• 0.9ml JC-1 着色运转液中放入 0.1ml 总核蛋白量为 10～100μg 纯化的线粒体。

• 用荧光分光光度计或荧光酶标仪查测：混匀后应该用荧光分光光度计来进行时光扫描机，增加光谱为 485nm，发射卫星光谱为 590nm。要的使用荧光酶标仪，增加光谱应该布置为 485nm 时，应该在 475～520nm 空间内布置增加光谱。另一，也应该决定性下部操作步骤 6

中的光谱设置成开展荧光判断。 d. 用荧光显微镜观测或激光行业共对焦显微镜观测观测：技巧同上边的步聚 6。

6、荧光测量和结论具体分析：

探测 JC-1 单个时能够把发挥光布置为 490nm，火箭导弹光布置为 530nm；探测 JC-1 汇聚反应物时，能够把发挥光布置为 525nm，火箭导弹光布置为 590nm。关注：在这儿核查荧光时并非把发挥光和火箭导弹光布置在zui大发挥激发光谱和zui大火箭导弹激发光谱。如便用荧光显微镜通过检查，探测 JC-1 单个时能够参考资料使用通过检查所有生态荧光时的布置，如通过检查 GFP 或 FITC 时的布置；探测 JC-1 汇聚反应物时能够参考资料使用通过检查所有红白色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 时的布置。现身生态荧光表明线粒体膜电极电势差增涨，与此同时该細胞很将会会出现細胞凋亡最早期。现身红白色荧光表明线粒体膜电极电势差很平常，細胞的状态下也很平常。

注意事项：

1、 JC-1 Stain(200×)应*溶解混匀后使用，但应避免反复冻融。必须先把 JC-1 用 ddH₂O 充分溶解混匀后，才可加入 JC-1 Buffer(1×)。不可先配制 JC-1 Buffer(1×)再加入

JC-1 Stain(200×)，一旦违反引致 JC-1 真难充分地溶水，造成 影响到后继的探测。

2、 这对于那些 6 孔板中的产品的备样，本生化微生物培养基盒共也是可以测量工具 100 个产品的备样；这对于那些 12 孔中的产品的备样，本生化微生物培养基盒共也是可以测量工具 200 个产品的备样。

3、 装入完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1×)干洗时，尽可能使 JC-1 Buffer(1×)长期保持 4℃之间，因此的干洗功能最好。

4、 JC-1 探头装完并清洗后做到在 30min 内达成随后检查，在检查前需冰浴储存。

5、 勿把 JC-1 Buffer(5×)完全调制成 1×，鉴于进行整个过程中需随便适用的 JC-1 Buffer(5×)。6、 如 JC-1 Buffer(5×)含有沉垫，必定完全容解后才会适用的，为推进容解都可以在 37℃进行加热。7、 CCCP 为线粒体手机表达链可抑药制剂，有一个定毒副作用，请要留意小心一点安全防护。

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