基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳试剂盒(MMP2/9)操作说明

1. 简介：
机质金属件球球蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无亲水性的酶原行驶排泌，滋养后也能挥发内部外机质的胶原球球蛋白，也叫胶原酶。实现损害内部外机质，胶原酶参于活动胚胎生长发育、基本特征发生了、策划 打造等方式，并参于活动慢性炎症、癌肿、心力管、精神等更多肠道疾病方式。血浆与策划 中的MMP-2、MMP-9参于活动一些生理上与方面的问题方式，其在深入分析诊治和治療中的实际意义越来越备受要重视。
 
2. 检测原理：
本采血管盒主要采用酶谱法(Zymography)查测MMP-2、MMP-9 化学活化。Zymography 就是一种喜欢并实用的、通过SDS-PAGE 电泳和反相疑胶的作用刺绣的淀粉酶酶酶查测做法，其精确度度led光通量1 nM，少于ELISA做法，其常规操作过程和流程是：制得加有胶原酶底物的SDS-PAGE 疑胶的作用，含淀粉酶酶酶的图纸此前疑胶的作用中实施电泳，电泳完成后卸下来疑胶的作用与酶化学体现Buffer 孵育，疑胶的作用刺绣与脱色。疑胶的作用中随着含底物淀粉酶酶而被深染，行成了深棕色后台，但在有淀粉酶酶酶条带的地段，淀粉酶酶酶将挥发疑胶的作用中的底物淀粉酶酶，以求不被刺绣而行成了剔透区，导致能也显示灯MMP-2、MMP-9 的数值地段(酶谱)及化学活化。本采血管盒具备MMP-2、MMP-9 特异淀粉酶酶底物及酶学化学体现缓存数据液，可查测少至0.1~0.5 μl 血细胞中的MMP-2、MMP-9 酶谱及化学活化，查测精确度度~1nM。采血管盒可实施50次基准小胶查测，但如果小胶加样孔为10~12个，则总额可查测500~750个图纸。
 
3. 检测目的:
本实验试剂盒使用探测MMP-2、MMP-9 酶谱及特异性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。
 
4.  试剂盒组成与储存：
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC；
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用的时用分馏水稀释溶液；
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 施用时用分馏水掺水；
E. SDS-PAGE 妇科凝胶核营养物质考马斯亮蓝复染液, 4 ºC。
 
5.检测步骤：
5.1 备制含MMP底物核蛋白的SDS-PAGE疑胶的作用的作用：举荐区分胶密度为8%。遵循的标准系统备制SDS PAGE疑胶的作用的作用。将10 × substrate G 开始融化，并90 ºC 热处理加热两一分钟。分开 在沉淀胶和区分胶中超额加如10 × substrate G 并使之就稀释10倍，混匀后加如过氢氧化钠铵和TEMED，等着疑胶的作用的作用缔合。
5.2 待测合格品1:1 溶解于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可进行标定：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混后会直接上样。岂能调温变形，然而仅应用不用回归剂的上样响应液。可在预经过多次实验发现选择加样量，应用寻常血清预染Marker 就可以。
弱阳差表(要选步骤之一)：可用人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积太结合，取5-15μl 上样。
注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，好的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照
5.3 低电压工作电流恒流电泳，每个块小胶电压工作电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出疑胶先进时结束了之电泳。
5.4 洗條凝露：抽出凝露，除去浓缩提炼胶，放置溶器内。可先用合适量水蒸气纯水清洁凝露，然而添加10 ml 1× Buffer A(用水蒸气纯水掺水)，环境温度浸洗凝露2 × 30 1分钟。中心换液。
5.5 孵育：扔掉Buffer A。加盟10 ml 1× Buffer B(蒸溜水稀释溶解)，制冷或37ºC 孵育1~5 h。抗体阳性差表还是血中的MMP 一般是37ºC 孵育1 h需先呈现。如MMP 活性酶低，应延后孵育时期为10h或住宿。
5.6 显色：垮掉Buffer B，加如SDS-PAGE疑胶淀粉酶酶质考马斯亮蓝复染剂液（工作过程见之后需附SDS-PAGE疑胶淀粉酶酶质考马斯亮蓝复染剂液阐明书）。疑胶的大有些区城被深染，在有MMP 条带的方位不被复染剂而变成光亮区城。
透亮区域划分的位子和区域警示MMP-2、MMP-9 的长宽比位子(酶谱)及可溶性。阳性反应参考将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位子显示透亮条带。
5.7 条带扫苗：将疑胶投入扫苗仪上扫苗。固然MMP条带透明化，但疑胶后台并不原本咖啡色。清理心思：能用的 非电子散射光扫苗，或用电脑软件影像清理过程调低后台彰显为灰度彰显，并硬着头皮装置为咖啡色。MMP 条带则为乳白色，这后台黑条带白的图片格式文件的英文翻译小论文里常见的图片格式文件。
6.说明：
1. 10 mM 也能EDTA*减缓MMP活性酶类。
2. 凝露烘干的：可致用高密度聚乙烯酰胺凝露干胶保护装置常温最快烘干的凝露，用作日志继承。
 

基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒(MMP2/9)操作说明

7.参考文献：
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202
 
SDS-PAGE 凝露淀粉酶质考马斯亮蓝染色剂液说明怎么写书
常规的考马斯亮蓝SDS-PAGE 抑菌凝胶的作用胆固醇质固色是调查室长用的抑菌凝胶的作用固色最简单的方式方法。银染最简单的方式方法虽然说迟钝度就越高，但需要备考微生物培养基缜密并有影响物有影响，实操步凑冗杂，难易保持可以获得好的固色特效。
 
脱色布骤：
1. 此脱色液其为做工作液，应用时直接的将聚丙稀酰胺抑菌凝胶存放在培养计划皿中以考马斯亮蓝脱色液网络覆盖凝
胶，并过慢晃动2h；
2. 倾去染色剂液，用脱色液冲洗器凝露；
3. 以脱色液包括凝露，慢慢地晃荡2h，倾去脱色液，后加入新脱色液通过脱色，随后得到 比较清楚的黑色的条带和卫生的时代情况（大部分此具体步骤要有2～4h，也可脱色隔夜至比较清楚的黑色的条带和卫生的时代情况）；
4. 对凝露实施介绍和抓拍，凝露可放入在7％的乙酸中保管。也可作凝露干胶裝置（P2000）对
妇科凝胶实行工作后导出。
卫生性：有甲醇，无专项 致癌性，按般化学上品进行操作细则处理。
证明：
1. 染色剂液成分：0.25g 考马斯亮蓝R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合型1h 后用
Whatman 1 号筛选棉筛选，于环境温度可无现期存放；
2. 脱色液配方法：冰醋酸钠:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 另存液：7％冰乙酸；
4. 抑菌凝胶上色此后，上色液也可以回报利用，放到新容器设计内，在常温或4 ºC 维持，可多次用2-4 次。

基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳试剂盒(MMP2/9)操作说明