1.制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDSPAGE凝胶。将10×substrateG融化，并90ºC加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10×substrateG并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
2.待测样品1:1稀释于2×SDS-PAGEnon-reducingbuffer（用完后可自行配制：4%SDS,100mMTris-ClpH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnolblue），混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker即可。阳性对照（可选步骤）：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血与100μl2×SDS-PAGEnonreducingbuffer等体积混合，取5-15μl上样。
3.低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4.洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml1×BufferA（用蒸馏水稀释），室温漂洗凝胶2×30分钟。中间换液。
5.孵育：倒掉BufferA。加入10ml1×BufferB（蒸馏水稀释），室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。
6.显色：倒掉BufferB，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置（酶谱）及活性。阳性对照将在66~72（MMP-2）、92（MMP-9）、130（proMMP-9）、225（proMMP-9）kDa
位置出现透明条带。
7.条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
更新时间：2016-05-20 
浏览次数：2194
您的位置：
