牛瘦素(LEP)ELISA试剂盒如何正确使用

牛瘦素(LEP)酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

第一部分  ELISA简介

ELISA是酶连接抗体物理吸附剂检测( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的代称。自上上个世纪70年初发明 十八大以来，进步比较快，当今已被广泛的用 于海洋生物和医疗完美的有很多各个领域。

ELISA的基础理论是抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性的固相化及抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性的酶标志图片。相相结合在固相各种承载面的抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性仍要保持其外表抗原细胞学活力酶，酶标志图片的抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性既使用其外表抗原细胞学活力酶，又使用酶的活力酶。在法旋光度的法测时，受检组织切片（法旋光度的法测这其中的外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性或抗原）与固相各种承载面的抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性起体现。用洗衣机清洗的手段使固相各种承载上形成了的抗原外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性包覆物与溶液中的任何杂质单独。另倒入酶标志图片的抗原或外表抗原细胞外表抗原细胞外表抗原阳性，也完成体现而相相结合在固相各种承载上。在此固相上的酶量与组织切片中受检杂质的量呈肯定的占比。倒入酶体现的底物后，底物被酶促使变成 稀有金属产品，产品的量与组织切片中受检杂质的量可以涉及到的，故可要根据呈色的深浅不同确定相关性或按量进行分析。在酶的促使吸收率很高，间接的地变小了外表抗原细胞体现的最后，使法旋光度的法测手段做到很高的皮肤敏感度。

第二部分 ELISA 的样本实验准备

在收集样本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备品。对隔天再测试的模本，实时灌装后冻的存在-20℃预备，有一件的，比较好-70℃冻存后备电源。动物标本应预防致使反复冻融。

液体类标本: 包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

• 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
• 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
• 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
• 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
• 培养细胞：检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
• 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂，用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
• 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃维持，但应避免反复冻融.
• 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

第三部分 ELISA试剂盒的检测目的和实验原理

1.验测依据

本试剂盒用于测定牛血清、血浆及相关液体样本中瘦素(LEP)含量。

2.实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛瘦素(LEP)水平。用纯化的牛瘦素(LEP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入瘦素(LEP)，再与HRP标记的瘦素(LEP)抗 体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的瘦素(LEP)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标 准曲线计算样品中牛瘦素(LEP)浓度。

第四部分  试剂盒组成

第五部分 操作步骤

• 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

• 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
• 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
• 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
• 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此

 重复 5 次，拍干。

• 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。
• 温育：操作同 3。
• 洗涤：操作同 5。
• 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

     10 分钟.

• 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
• 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。
• 操作程序总结：

第六部分  计算

以标准物的浓度为横坐标，OD  值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。

              第七部分  注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值 大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

第八部分 检测范围

0.1μg/L -4μg/L

第九部分 保存条件及有效期

1．试剂盒保存：2-8℃

2．有效期：6 个月

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